石蠟包埋組織切片免疫染色實驗步驟
實驗步驟（建議方案）：
石蠟包埋組織切片3~4μm 厚度
1.烤片： 將待做切片置于切片架上，于60℃恒溫烤箱中至少烤1 hr；
2.脫蠟： 切片放入盛有二甲本苯的容器中脫蠟3次（即二甲本苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化： 切片經(jīng)下行酒精水化，無水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自來水沖洗，ddH2O洗2×2min；
4.抗原修復： 根據(jù)抗體說明書推薦方法進行抗原修復，常采用高壓、微波（溫度達到98~100℃）或酶消化修復法，室溫自然冷卻，自來水沖洗，ddH2O洗2×2min，TBS洗滌（2×2min）（具體修復方法見附1）* 注：有些抗原勿需修復，直接進入第5步封閉。
5.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用試劑C（即用型一抗），37℃濕盒孵育2 hr 或4℃過夜；
7.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
8.封閉： 滴加試劑B，37℃濕盒孵育10 min；
9.加二抗： 滴加用抗體稀釋液稀釋的生物素化二抗（試劑D），37℃濕盒中孵育30 min；
10.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min）；
11.封閉： 滴加試劑Tween 20，37℃濕盒孵育封閉20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用抗體稀釋液稀釋的試劑E（1：50~200，終濃度5~20 nM），37℃濕盒中孵育30 min；
13.洗滌： TBS-T洗滌（3×5 min），TBS洗滌（2×5 min）；
14.顯色：應用DAB溶液（試劑F）顯色；
15.復染：自來水充分沖洗，復染，脫水，透明；
16.封片： 待組織標本干后，用試劑緩沖甘油封固劑封片；
17.觀察成像： 顯微鏡下觀察成像。
注意事項：
1. 修復后緩沖液須自然冷卻，自來水沖洗后方能把切片取出，驟冷有可能導致結(jié)晶或抗原封閉。
2. 緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復使用。
3. 若試劑為微量濃縮液，用前應低速離心，將內(nèi)蓋和管壁附著的溶液離到底部。
4. 封片前一定要換用TBS充分洗滌，以便洗去組織上殘留的Tween 20，否則會影響結(jié)果觀察。
5. 如須復染細胞核，則在封片前復染或直接采用含有染核試劑的封片劑進行封片。
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