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    公司的獸藥殘留快速檢測試劑盒（例：克倫特羅檢測試劑盒、氯霉素檢測試劑盒、硝基呋喃類檢測試劑盒）、動物疾病診斷試劑（例：豬弓形蟲抗體檢測試劑盒、豬藍耳病檢測試劑盒、豬瘟病毒檢測試劑盒）、分子生物學工具酶、綠色水產藥品等一系列的產品已在國家機關、企業(yè)、科研單位廣為應用。

畜禽（組織﹑尿樣﹑血清）檢測產品：

新霉素

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物新霉素將和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭抗新霉素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物新霉素的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物新霉素的含量。

二、試劑盒特性

• 試劑盒靈敏度：   0.1ppb
• 孵育溫度：       25℃
• 孵育時間：       30min～15min
• 樣本檢測下限

肌肉組織                                4ppb

蜂    蜜                                4ppb

牛奶、奶粉                              4ppb

• 交叉反應率

新霉素                                 100%

鏈霉素                               ﹤0.1%

慶大霉素                             ﹤0.1%

雙氫鏈霉素                           ﹤0.1%

卡那霉素                             ﹤0.1%

妥布霉素                            ﹤0.1%

紫蘇霉素                            ﹤0.1%

• 樣本回收率

肌肉組織                            90±30%

雞肝、豬肝                          70±17%

牛奶、奶粉                          90±30%

蜂蜜                                90±30%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標儀、均質器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：氫氧化鈉、三氯乙suan

五、樣本前處理步驟

• 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

• 樣本前處理需配制：

配液1  3%三氯乙suan溶液：

稱取3 g三氯乙suan加去離子水100ml溶解。

配液2  2%三氯乙suan溶液：

稱取2 g三氯乙suan加去離子水100ml溶解。

配液3  2M NaOH溶液：

稱8g NaOH加去離子水定容至100ml。

配液4  樣本復溶液：

將2X濃縮復溶液用去離子水按1：1稀釋。

• 樣本處理：

（a）組織（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）處理方法

• 稱取2 g±0.05 g均質后的組織樣本于50ml離心管中，加入8ml 3%三氯乙suan，振蕩5min，室溫4000r/min以上離心10min；
• 取出2ml上清液于另一試管中，用2M NaOH調pH值至7.0～7.5之間（大約加入100µl）。取調pH值后的液體用樣本復溶液1：4（100µl+400µl樣本復溶液）稀釋，混合30s；
• 取50 µl用于分析

樣本稀釋倍數:  20倍 

（b）蜂蜜、奶粉、牛奶處理方法

• 稱取2 g±0.05 g（牛奶取2ml）樣本于50ml離心管中，加入8ml 2%三氯乙suan，振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min；
• 取出2ml上清液于另一試管中，用2M NaOH調pH值至8.0左右（大約加入100µl）。取調pH值后的液體用樣本復溶液1：4（100µl+400µl樣本復溶液）稀釋，混合30s；
• 取50µl用于分析

樣本稀釋倍數:  20倍 

六、 酶標免疫分析程序:

• 測定前應須知：

• 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
• 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。
• 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
• 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

• 操作步驟：

• 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
• 取出框架及需要數量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
• 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
• 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
• 加標準品/樣品50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物50µl/孔，然后再加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，25℃環(huán)境中反應30min。
• 將孔內液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
• 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。
• 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內讀數），測定每孔OD值。

七、結果判定

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含新霉素量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中新霉素實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以新霉素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中新霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。

八、 注意事項

• 室溫低于25℃或試劑及標本未回到室溫（20～25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
• 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
• 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。
• 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
• 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
• 不用的微孔板放進自封袋重新密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
• 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。標準品1的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。
• 該試劑盒zui佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質期

• 儲藏條件：試劑盒于2～8℃保存，不要冷凍。
• 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

提示：酶標板真空包裝袋若有漏氣，酶標板仍然正常有效，不影響實驗結果，請放心使用。

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