業(yè)執(zhí)照.jpg)
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| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) | |
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人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液說明書
【包裝規(guī)格】
200ml/瓶
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
A． 適用儀器
zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
B． 耗材
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)地 |
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15ml 離心管散裝 | 339650 | 美國(guó) NUNC |
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15ml 離心管架裝 | 339651 | 美國(guó) NUNC |
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50ml 離心管散裝 | 339652 | 美國(guó) NUNC |
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50ml 離心管架裝 | 339653 | 美國(guó) NUNC |
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無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
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【檢驗(yàn)方法】 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。 首先根據(jù)樣本量大小，分以下幾種情況：
一、 使用 15ml 離心管時(shí)：
情況 A：血液樣本量小于 3ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè) 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
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| 本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測(cè) | |
| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) | |
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8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1000g）。
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè) 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
二、 使用 50ml 離心管時(shí)：
情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè) 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
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| 本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測(cè) | |
| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) | |
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8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時(shí)，實(shí)驗(yàn)方法如下：
1. 取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，650-110g，離心 20-30min（注：根據(jù)血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件 需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果，但zui大離心力不超過 1200g）。
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè) 核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管 中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
5. 250g，離心 10min。
6. 棄上清。
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
8. 250g，離心 10min。
9. 重復(fù) 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
【注意事項(xiàng)】
1. 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 在取血 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血液存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2. 本實(shí)驗(yàn)不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3. 吸取過多的單個(gè)核細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的
粒細(xì)胞數(shù)量增加。
4. 吸取過多的單個(gè)核細(xì)胞層上層溶液會(huì)導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
5. 如所實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請(qǐng)以尋求幫助，具體 詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
6. 當(dāng)血液樣本粘度過高需稀釋時(shí)，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號(hào)：
2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當(dāng)?shù)南♂尫椒〞?huì)降低細(xì)胞得率及活性。如血液樣
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| 本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測(cè) |
| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) |
本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當(dāng)降低離心力和離心時(shí)間。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)淋巴細(xì)胞提取率及純度均大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
| 紅細(xì)胞 |
| 白細(xì)胞 |
| 血小板 |
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| （4.0-10.0）×109 |
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| （4.0-5.5）×1012 |
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| （1.0-3.0）×1011 |
含量（個(gè)/L） | 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | ||
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| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
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【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】 |
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1. 所獲得淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2. 所獲得淋巴細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
3. 所獲得淋巴細(xì)胞的鑒定方法 A.流式細(xì)胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù) 注：上述技術(shù)方案詳情請(qǐng)登陸本搜索“細(xì)胞
分離、純化、擴(kuò)增及鑒定指導(dǎo)手冊(cè)”，并在說明書項(xiàng)目欄下下載使用。 【可能存在的問題及解決方法】
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
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離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
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離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng) |
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離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
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離心后白環(huán)層太淺或看不見 | 細(xì)胞密度過小 |
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2. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
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| 本品只能用于科學(xué)研究，不能用于臨床檢測(cè) |
| 本品于 GMP 標(biāo)準(zhǔn)下生產(chǎn) |
區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離
心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效 果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。
