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氯——#霉素

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氯霉素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物氯霉素的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：   0.02ppb

u 孵育溫度：       25℃

u 孵育時(shí)間：       30min～30min～15min

u 樣本檢測下限

蛋類、牛奶（方法一） ···························· 0.04ppb

尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉··················· 0.02ppb

組織、肝臟、蜂蜜、牛奶（方法二）············· 0.01ppb

u 交叉反應(yīng)率

氯+#霉素·     ······································· 100%

甲砜+#霉素   ······································ < 0.1%

氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%

u 樣本回收率

組織、肝臟 ································  85%±20%

蜂蜜、腸衣 ································  83%±25%

牛奶、飼料 ································  75%±23%

尿液、血清 ································  70%±18%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：乙酸乙酯、乙腈、亞硝基鐵氰+#化鈉、葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)、硫酸鋅、醋酸鈉、正己烷、醋酸

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 樣本前處理需配制：

配液1 C液（牛奶、奶粉樣本）：

10.7g 亞硝基鐵氰+#化鈉加去離子水100ml溶解。

配液2  D液（牛奶、奶粉樣本）：

28.8g硫酸鋅加去離子水100ml溶解。

配液3 pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液（尿樣本）：稱2.4g醋酸鈉和1.2ml醋酸加去離子水500ml溶解混合。

配液4 乙腈-水溶液：

 V_乙腈：V_H2O＝84：16

配液5 樣本復(fù)溶液：

將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水，用于抗體的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶)。

u 樣本處理：

（a）組織、肝臟樣本處理方法

1、 稱取均質(zhì)后的樣本3±0.05g于50ml離心管中，先加入3ml去離子水混勻后再加入6ml乙酸乙酯，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；

2、 取出4ml上層液體在50-60℃氮?dú)饬髦写蹈桑?/span>

3、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml樣本復(fù)溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；去除上層有機(jī)相；

4、 取50 µl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  0.5倍

（b）血清血漿處理方法

1、 取1ml血清或血漿至試管中，加2ml乙酸乙酯振蕩1min；靜置使水相與有機(jī)相分層或室溫4000r/min離心5min；

2、 移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮?dú)饬?/span>50℃水浴中干燥；殘留物用1 ml樣本復(fù)溶液溶解，混合30s；

3、 取50 µl下層相用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

（c） 尿液處理方法

1、 移取2ml尿液到離心管中，加pH4.8 100mM醋酸鈉緩沖液0.5ml混合；加40µl葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在37℃水解至少2小時(shí)（或過夜）；

2、 該溶液恢復(fù)至室溫后加入8ml乙酸乙酯混合1min；室溫4000r/min離心10min，取出4ml上層液體在氮?dú)庀?/span>50～60℃干燥；

3、 用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

4、 取50µl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):  1倍

（d）蜂蜜處理方法

1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入離心管中，用4ml去離子水溶解；加入4ml乙酸乙酯振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；

2、 移取2ml上層清澈液到另一離心管中，50-60℃氮?dú)饬飨赂稍?；?/span>0.5ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

3、 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：  0.5倍  

檢測下限：0.025ppb      定量下限：0.1 ppb

注：我們推薦0.1 ppb為陽性樣本的cut off值。

（e）腸衣處理方法

1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；注：干樣本需剪碎（長度不超5mm）后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂洗20min以上去除表面的鹽份，瀝干后再均質(zhì)；

2、 稱1±0.05g均質(zhì)后的樣本于50ml離心管中，加入10ml乙酸乙酯，振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min；

3、 取5ml上層液體（相當(dāng)于0.5g的樣本）在氮?dú)饬飨?/span>50-60℃干燥；

4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加0.5ml樣本復(fù)溶液振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；除上層有機(jī)相；

5、 取下層50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：  1倍

（f）牛奶樣本處理方法一

1、 將牛奶樣本10℃4000r/min以上離心10min處理，吸除上層脂肪；然后取5ml去除脂肪奶樣至50ml離心管中，加入150µl C液出現(xiàn)沉淀，短暫振蕩后加入150µl D液混合；

2、 15℃4000r/min以上離心10min，移取上層液；用樣本復(fù)溶液以等體積稀釋上層液，混合30s；

3、 取50µl用于分析。

注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。

樣本稀釋倍數(shù)：2      

檢測下限：0.1ppb   定量下限：0.15ppb

（g）牛奶樣本處理方法二

1、 將牛奶樣本10℃4000r/min以上離心10min處理，吸除上層脂肪；然后取5ml去除脂肪奶樣至50ml離心管中，加入250µl C液和250µl D液*混合，4-12℃4000r/min以上離心10min。如無冷凍離心機(jī)，將樣本置冰箱中冷卻到8℃；

2、 轉(zhuǎn)移出2.2ml上層液（相當(dāng)于2ml奶樣）至新的離心管中，加入4ml乙酸乙酯上振蕩2min；室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min ；

3、 吸取2ml乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于1ml奶樣），50-60℃氮?dú)饬飨?干燥；用0.5ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

4、 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5

檢測下限：0.025ppb    定量檢測限：0.05ppb

由于陰性樣本可能會(huì)產(chǎn)生背景干擾 （在某些

情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽性結(jié)果的CUT OFF判斷值。

（h）奶粉樣本處理方法

1、 稱2±0.05 g奶粉至50ml離心管中，加入10ml去離子水振蕩溶解；加入1ml C液和1ml D液*混合；4-12℃4000r/min以上離心10min。若無冷凍離心機(jī)，請預(yù)先將樣本冷卻到8℃；

2、 轉(zhuǎn)移出3.6ml上層液（相當(dāng)于0.6g奶粉）至新的離心管中，加入6ml乙酸乙酯振蕩5min；室溫（20-25℃）4000r/min以上離心10min；

3、 吸取4ml乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于0.4g奶粉），50-60℃氮?dú)饬飨?干燥；用0.4ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合30s；

4、 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1    

檢測下限：0.05ppb     定量檢測限：0.15ppb

由于陰性樣本可能會(huì)產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3作為陽性結(jié)果的CUT OFF判斷值。

（i）蛋類處理方法

1、 稱取3±0.05 g均質(zhì)的樣本，加入9ml乙腈-水溶液振蕩2min，15℃4000r/min以上離心10min；

2、 取3ml上層相與3ml去離子水水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯，混合1min，15℃4000r/min以上離心10min；取上層有機(jī)相置50-60℃下氮?dú)饬鞔蹈桑?/span>

3、 加入1ml正己烷溶解殘留物后，用2ml樣本復(fù)溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；去除上層有機(jī)相；

4、 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：2    

檢測下限：0.1ppb     定量檢測限：0.3ppb

（j）飼料處理方法

1、 稱取2±0.05g均質(zhì)過的飼料樣本，加入2ml去離子水，再加入6ml乙酸乙酯，充分振蕩2min，15℃ 4000r/min以上離心10min；

2、 取3ml上層有機(jī)相到試管中56℃下氮?dú)獯蹈桑?/span>

3、 加入1ml正己烷溶解殘留物，用1ml樣本復(fù)溶液混合30s，室溫4000r/min以上離心5min；去除上層有機(jī)相；

4、 取50 µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

u 測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 將濃縮抗體用樣本復(fù)溶液11倍稀釋（1份抗體加入10份稀釋液，按需配制使用）

6、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

7、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

9、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

10、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含氯霉素量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.02ppb為1.816；0.06ppb為1.415；0.18ppb為0.74；0.54ppb為0.313；1.62ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是0.54ppb～1.62ppb；樣本2的濃度范圍是0.06ppb～0.18ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實(shí)際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

八、 注意事項(xiàng)

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期

1、 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請放心使用。

從2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤色服務(wù)，協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色，是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!

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