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氯霉素殘留快速檢測試劑盒操作說明書

點擊次數(shù)：2567 更新時間：2020-11-23

氯霉素快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物氯霉素將和微

孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗氯霉素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物氯霉素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物氯霉素的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度： 0.05ppb

u 孵育溫度： 25℃

u 孵育時間： 30min～30min～15min

樣本檢測下限

蛋類、牛奶（方法一）····························· 0.1 ppb 尿液、血清、腸衣、飼料、奶粉··················· 0.05ppb 組織、肝臟、蜂蜜、牛奶（方法二）············· 0.025ppb

交叉反應(yīng)率

氯霉素· ······································· 100%

甲砜霉素 ······································ < 0.1%

氟甲砜霉素 ······································ < 0.1%

樣本回收率

組織、肝臟 ································			85%±20%
蜂蜜、腸衣 ································			83%±25%
牛奶、飼料 ································			75%±23%
尿液、血清 ································			70%±18%
三、試劑盒組成

1	微量測試孔	每條 8 孔，一板 12 條

	標(biāo)準(zhǔn)液×6 瓶	0ppb	0.05ppb
2	標(biāo)準(zhǔn)液×6 瓶	0.15ppb	0.45ppb
2	（1ml/瓶）	0.15ppb	0.45ppb
	（1ml/瓶）	1.35ppb	4.05ppb
		1.35ppb	4.05ppb

3	酶標(biāo)記物	12ml	紅色帽

4	抗體濃縮液	1ml	藍(lán)色帽

5	底物 A 液	7ml	白色帽

6	底物 B 液	7ml	黑色帽

7	終止液	7ml	黃色帽

8	20X 濃縮洗滌液	40ml	白色帽

9	2X 濃縮復(fù)溶液	50ml	透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl

試劑：乙酸乙酯、乙腈、亞硝基鐵qing化鈉、葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)、硫酸鋅、醋酸鈉、正己烷、醋酸

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理需配制：

配液 1 C 液（牛奶、奶粉樣本）：

10.7g 亞硝基鐵qing化鈉加去離子水 100ml 溶解。

配液 2 D 液（牛奶、奶粉樣本）：

28.8g 硫酸鋅加去離子水 100ml 溶解。

配液 3 pH4.8 100mM 醋酸鈉緩沖液（尿樣本）：稱 2.4g 醋酸鈉和 1.2ml 醋酸加去離子水500ml 溶解混合。

配液 4 乙腈-水溶液：乙腈：VH2O＝84：16

配液 5 樣本復(fù)溶液：將 2X 濃縮復(fù)溶液用去離子水按 1：1 稀釋。

	(1 份濃縮復(fù)溶掖+1 份去離子水，用于抗體	氮氣流下干燥；用 0.5ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥
	的稀釋和樣本提取后的復(fù)溶)。	的殘留物，混合 30s；
u	樣本處理：	3、取 50 µl 用于分析。
（a）組織、肝臟樣本處理方法		樣本稀釋倍數(shù)： 0.5 倍
1、稱取均質(zhì)后的樣本 3±0.05g 于 50ml 離心管中，		檢測下限：0.025ppb	定量下限：0.1 ppb
	先加入 3ml 去離子水混勻后再加入 6ml 乙酸乙	注：我們推薦 0.1 ppb 為陽性樣本的 cut off 值。
	酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min 以上離心 10min；	（e）腸衣處理方法
2、取出 4ml 上層液體在 50-60℃氮氣流中吹干；		1、用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；注：干樣本需剪碎（長度
3、加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 1ml		不超 5mm）后再均質(zhì)，濕樣本需用去離子水漂
	樣本復(fù)溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心	洗 20min 以上去除表面的鹽份，瀝干后再均質(zhì)；
	5min；去除上層有機相；	2、稱 1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于 50ml 離心管中，加
4、取 50 µl 下層相用于分析。		入 10ml 乙酸乙酯，振蕩 2min，室溫 4000r/min
	樣本稀釋倍數(shù): 0.5 倍	以上離心 10min；
（b）血清血漿處理方法		3、取 5ml 上層液體（相當(dāng)于 0.5g 的樣本）在氮氣
1、取 1ml 血清或血漿至試管中，加 2ml 乙酸乙酯		流下 50-60℃干燥；
	振蕩 1min；靜置使水相與有機相分層或室溫	4、加入 1 ml 正己烷溶解干燥的殘留物，再加 0.5ml
	4000r/min 離心 5min；	樣本復(fù)溶液振蕩混合 30s，室溫 4000r/min 以上
2、移取上層的乙酸乙酯至另一試管中，用氮氣流		離心 5min；除上層有機相；
	50℃水浴中干燥；殘留物用 1 ml 樣本復(fù)溶液溶	5、取下層 50 µl 用于分析。
	解，混合 30s；	樣本稀釋倍數(shù)： 1 倍
3、取 50 µl 下層相用于分析。		（f）牛奶樣本處理方法一
	樣本稀釋倍數(shù): 1 倍	1、將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處
（c）尿液處理方法		理，吸除上層脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶樣
1、移取 2ml 尿液到離心管中，加 pH4.8 100mM 醋		至 50ml 離心管中，加入 150µl C 液出現(xiàn)沉淀，
	酸鈉緩沖液 0.5ml 混合；加 40µl 葡萄糖苷酸酶	短暫振蕩后加入 150µl D 液混合；
	(Merck,Art.No.4114)到稀釋的尿液中，在 37℃	2、 15℃4000r/min 以上離心 10min，移取上層液；
	水解至少 2 小時（或過夜）；	用樣本復(fù)溶液以等體積稀釋上層液，混合 30s；
2、該溶液恢復(fù)至室溫后加入 8ml 乙酸乙酯混合		3、取 50µl 用于分析。
	1min；室溫 4000r/min 離心 10min，取出 4ml	注：如果離心后仍然渾濁，再重復(fù)沉淀過程。
	上層液體在氮氣下 50～60℃干燥；	樣本稀釋倍數(shù)：2
3、用 1ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合		檢測下限：0.1ppb	定量下限：0.15ppb
	30s；	（g）牛奶樣本處理方法二
4、取 50µl 用于分析。		1、將牛奶樣本 10℃4000r/min 以上離心 10min 處
	樣本稀釋倍數(shù): 1 倍	理，吸除上層脂肪；然后取 5ml 去除脂肪奶樣
（d）蜂蜜處理方法		至 50ml 離心管中，加入 250µl C 液和 250µl D
1、取 2±0.05 g 蜂蜜，放入離心管中，用 4ml 去離		液*混合，4-12℃4000r/min 以上離心 10min。
	子水溶解；加入 4ml 乙酸乙酯振蕩 2min，室溫	如無冷凍離心機，將樣本置冰箱中冷卻到 8℃；
	4000r/min 以上離心 10min；	2、轉(zhuǎn)移出 2.2ml 上層液（相當(dāng)于 2ml 奶樣）至新
2、移取 2ml 上層清澈液到另一離心管中，50-60℃		的離心管中，加入 4ml 乙酸乙酯上振蕩 2min；

室溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min ； 3、吸取2ml 乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于1ml 奶樣），

50-60℃氮氣流下*干燥；用 0.5ml 樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合 30s；

4、取 50µl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：0.5

檢測下限：0.025ppb 定量檢測限：0.05ppb

由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾（在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn) 2 到 3 之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn) 3 作為陽性結(jié)果的 CUT OFF 判斷值。

（h）奶粉樣本處理方法

1、稱 2±0.05 g 奶粉至 50ml 離心管中，加入 10ml

去離子水振蕩溶解；加入 1ml C 液和 1ml D 液

*混合；4-12℃4000r/min 以上離心 10min。

若無冷凍離心機，請預(yù)先將樣本冷卻到 8℃；

2、轉(zhuǎn)移出 3.6ml 上層液（相當(dāng)于 0.6g 奶粉）至新的離心管中，加入 6ml 乙酸乙酯振蕩 5min；室溫（20-25℃）4000r/min 以上離心 10min；

3、吸取 4ml 乙酸乙酯上層液體（相當(dāng)于 0.4g 奶粉），50-60℃氮氣流下*干燥；用 0.4ml 樣

本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混合 30s； 4、取 50 µl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1

檢測下限：0.05ppb 定量檢測限：0.15ppb

由于陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾（在某些情

況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn) 2 到 3 之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn) 3 作為陽性結(jié)果的 CUT OFF 判斷值。

（i）蛋類處理方法

1、稱取 3±0.05 g 均質(zhì)的樣本，加入 9ml 乙腈-水溶液振蕩 2min，15℃4000r/min 以上離心 10min；

2、取 3ml 上層相與 3ml 去離子水水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯，混合 1min，15℃4000r/min 以上離心 10min；取上層有機相置 50-60℃下氮氣流吹干；

3、加入 1ml 正己烷溶解殘留物后，用 2ml 樣本復(fù) 溶液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；

去除上層有機相； 4、取 50 µl 用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：

		檢測下限：0.1ppb	定量檢測限：0.3ppb		7、將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液 250µl/孔
（j）飼料處理方法					洗板 4～5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙
1、稱取 2±0.05g 均質(zhì)過的飼料樣本，加入 2ml 去					拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺
		離子水，再加入 6ml 乙酸乙酯，充分振蕩 2min，			破）。
		15℃ 4000r/min 以上離心 10min；			8、每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃
2、取 3ml 上層有機相到試管中 56℃下氮氣吹干；					環(huán)境中反應(yīng) 30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌
3、加入 1ml 正己烷溶解殘留物，用 1ml 樣本復(fù)溶					液充分洗，4～5 遍（同上），用吸水紙拍干（拍
		液混合 30s，室溫 4000r/min 以上離心 5min；去			干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
		除上層有機相；			9、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B
4、取 50 µl 用于分析。					液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯
		樣本稀釋倍數(shù)：1			色 15min。
六、酶標(biāo)免疫分析程序:					10、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，
					設(shè)定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/63
u		測定前應(yīng)須知：
					0nm 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。
1、使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫

		（20～25℃）。			七、結(jié)果判定
2、使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。					結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方
3、在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于					法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與
		洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定			其所含氯霉素量成負(fù)相關(guān)。
		程序中的要點。			1、粗略判定：
4、所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜					用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出
		蓋住微孔板。			其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，
u		操作步驟：			樣本 2 的吸光度值為 1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：
1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～					0ppb 為 2.243；0.05ppb 為 1.816；0.15ppb 為 1.415；
		25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使			0.45ppb 為 0.74；1.35ppb 為 0.313；4.05ppb 為 0.155。
		用前均須搖勻。			則樣本 1 的濃度范圍是 1.35ppb～4.05ppb；樣本 2
2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放					的濃度范圍是 0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應(yīng)的稀
		入自封袋，保存于 2-8℃。			釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。
3、配液：將 40ml 濃縮洗滌液（20 倍濃縮）用去					2、定量分析
		離子水按照 1：19 稀釋（1 份濃縮洗滌液+19 份			（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分
		去離子水），或按所需用量配制洗滌液。			吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙
4、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每					孔）除以第-個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘
		個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和			以 100%，即
		樣本孔所在的位置。				B
5、將濃縮抗體用樣本復(fù)溶液 11 倍稀釋（1 份抗體					百分吸光率（%）＝		×100%


	加入 10 份稀釋液，按需配制使用）			B0
				B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
	6、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加
				B₀—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
	加入抗體工作液 50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕
				（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
	振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng) 30min。

				以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)

品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn) 曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋 倍數(shù)即為樣本中氯霉素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。

八、注意事項

1、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～

25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo) 準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒Z佳反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期